石油煉化廢水是污染較嚴(yán)重和治理領(lǐng)域中處理難度較大的一類工業(yè)廢水,其特征是高氨氮,污染物成份復(fù)雜、濃度高且多為生物難降解有毒有害有機(jī)物,水質(zhì)、水量的波動(dòng)幅度大。相比物理法和化學(xué)法,生物法具有去除污染物的種類多,效率高、抗沖擊能力強(qiáng)、處理成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前,針對(duì)可生化性差、可生化利用率低的石油煉化廢水,石油煉化企業(yè)通常采用A2/O和A/O等常規(guī)生物脫氮工藝技術(shù),但這些技術(shù)的氨氮去除負(fù)荷低、溶解氧消耗量大,而且由于硝化細(xì)菌世代周期長(zhǎng),上述單污泥系統(tǒng)運(yùn)行方式使氨氮硝化易受復(fù)雜的高濃度有機(jī)物影響,運(yùn)行不穩(wěn)定。新型處理技術(shù),如臭氧氧化技術(shù),電化學(xué)和光化學(xué)法與氧化劑(如H2O2,O3和Cl2等)結(jié)合使用的技術(shù)盡管對(duì)于污水的處理和回用方面存在一定的優(yōu)勢(shì),但由于能耗和處理費(fèi)用較高,生產(chǎn)上尚未大量應(yīng)用。
厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,ANAMMOX)是指在厭氧條件下微生物直接以NH4+為電子供體,以NO2-為電子受體的氧化還原反應(yīng),產(chǎn)物為N2。隨著水處理技術(shù)的不斷發(fā)展,厭氧氨氧化技術(shù)以其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)對(duì)于石油煉化廢水的處理工藝研究主要集中在A/O生物法曝氣生物濾池((biological aerated filter, BAF)、臭氧一曝氣生物濾池、三元微電解-Fenton試劑氧化法、臭氧一固定化生物活性炭濾池和懸浮填料移動(dòng)床生物膜法(moving bed biofilm re-actor, MBBR)等技術(shù),但關(guān)于將厭氧氨氧化技術(shù)應(yīng)用到石油煉化廢水的處理和探究對(duì)其菌群影響的研究較少。
本實(shí)驗(yàn)利用已具有高效脫氮性能的厭氧氨氧化一反硝化細(xì)菌混培物建立生物脫氮反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)馴化實(shí)驗(yàn),旨在探究石油煉化廢水中COD和毒性物質(zhì)對(duì)于脫氮處理應(yīng)用過(guò)程中厭氧氨氧化一反硝化細(xì)菌混培物的影響。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1. 1實(shí)驗(yàn)裝置
本實(shí)驗(yàn)裝置由原水箱、上向流移動(dòng)床厭氧氨氧化反應(yīng)器、反應(yīng)器進(jìn)水泵三部分組成。原水箱總?cè)莘e為20 L。反應(yīng)器材質(zhì)為有機(jī)玻璃,形式為圓筒形,內(nèi)徑為42 mm,高為400 mm。反應(yīng)器底部為厚度70 mm的承托層,由粒徑為2 - 20 mm砂礫石組成。承托層以上裝填80 mm高的由厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌為核心的細(xì)菌混培菌塊構(gòu)成有效生化反應(yīng)區(qū)。反應(yīng)器的總?cè)莘e0. 5 L,有效反應(yīng)容積0. 11 L,運(yùn)行方式采用上向流。反應(yīng)器外表面用黑塑料薄膜包裹,以防光線對(duì)細(xì)菌混培物的負(fù)面影響。反應(yīng)器進(jìn)水泵為蠕動(dòng)泵,額定流量為0.2-2.0 L/h。具體實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1。
1. 2細(xì)菌來(lái)源
該反應(yīng)器中所用厭氧氨氧化一反硝化細(xì)菌混培物取自已穩(wěn)定運(yùn)行6個(gè)月的厭氧氨氧化生物濾池反應(yīng)器。生物濾池運(yùn)行工況:進(jìn)水溫度33℃,進(jìn)水基質(zhì)濃度NH4+ -N 200 mg / L ( NO2- -N與NH4+ -N濃度比為1. 0一1.3),TN去除負(fù)荷為13. 5 kg · ( m3·d)-1,三氮化學(xué)計(jì)量比為NH4+ -N去除量:NO2- -N去除量:NO3- -N產(chǎn)生量=1:1 .34:0. 20。
1. 3實(shí)驗(yàn)原水
實(shí)驗(yàn)原水采用人工配制,由石油煉化廢水和基礎(chǔ)配制原水兩部分組成,石油煉化廢水取自天津市大港區(qū)某石化企業(yè)氣浮池出水,基本組分為:NH4+ -N濃度為80 mg / L , pH為7.45,COD濃度為675 mg / L ;基礎(chǔ)配制原水由脫除余氯的自來(lái)水、NH4 Cl , NaNO2 ,KH2PO4、FeCl3·6H2O和NaHCO3等組成。
配制方法:不同階段配制的實(shí)驗(yàn)原水成分為NH4+ -N濃度278. 28一229. 93 mg / L; NO2- -N濃度201. 51 - 319. 55 mg / L ( NH4+ -N和NO2- -N的濃度據(jù)實(shí)驗(yàn)要求按需配制且比例控制在1:1.3左右);KH2PO4濃度10 mg / L; NaHCO3濃度200mg / L;FeCl3· 6H2O濃度4.0 mg / L;COD由石油煉化廢水帶入,不需另行投加。原水的pH值采用2. 0 mol / L的HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。原水配制過(guò)程中,為了補(bǔ)充微量元索,另投加體積分?jǐn)?shù)0. 17%的滅菌生活污水。原水成分及反應(yīng)器運(yùn)行條件見(jiàn)表1。
1. 4實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)水流量為0. 4 L / h,水溫為(29士1) ℃,通過(guò)控制石油煉化廢水的添加比例并采用連續(xù)進(jìn)水的方式,將NO2- -N與NH4+-N濃度比控制在1. 30左右。通過(guò)不同階段石油煉化廢水的添加,實(shí)現(xiàn)在不斷增大難降解COD及毒性物質(zhì)濃度的情況下,考察以厭氧氨氧化一反硝化細(xì)菌為核心的細(xì)菌混培物在脫氮生化過(guò)程中對(duì)COD和毒性物質(zhì)的耐受能力。同時(shí),以第I階段中NH4+-N去除量和第II階段中反硝化總脫氮量分別作為衡量厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌活性指標(biāo)和變化標(biāo)準(zhǔn),探究石油煉化廢水中COD及毒性物質(zhì)對(duì)厭氧氨氧化一反硝化細(xì)菌混培物的影響。
另外,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)與倍比稀釋法(most probable num-ber, MPN)相結(jié)合的MPN-PCR技術(shù),對(duì)馴化前后兩類主要細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù),探究馴化前后菌群的數(shù)目變化情況。
考慮到反應(yīng)體系的水力停留時(shí)間為1. 25 h,而針對(duì)該反應(yīng)體系,重點(diǎn)考察的是石油煉化廢水對(duì)于細(xì)菌混培物的影響而非脫氮效率,所以實(shí)驗(yàn)中未控制最終出水指標(biāo)。
1. 5分析項(xiàng)目及檢測(cè)方法
實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程中涉及到的分析項(xiàng)目及檢測(cè)方法見(jiàn)表2。
MPN-PCR技術(shù)將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)與倍比稀釋法相結(jié)合,選取不同稀釋梯度的樣品分別做4組不同稀釋度的16個(gè)平行樣進(jìn)行PC R擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物特征堿基序列的電泳條帶確定陽(yáng)性反應(yīng),結(jié)果用來(lái)計(jì)算各樣品的陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)確定數(shù)量指標(biāo),然后從MPN統(tǒng)計(jì)計(jì)算表中查出相應(yīng)的細(xì)菌近似數(shù)。
1. 6數(shù)據(jù)處理及分析方法
當(dāng)采用分光光度法檢測(cè)COD時(shí),由于實(shí)驗(yàn)原理中采用氧化劑和助催化劑,水樣中的還原性物質(zhì)會(huì)與氧化劑進(jìn)行反應(yīng),所以測(cè)定時(shí),NO2- -N可被氧化劑氧化而使測(cè)定值比實(shí)際值偏高,因此水樣實(shí)際COD應(yīng)扣除由NO2- -N所導(dǎo)致的COD誤差。在水樣COD濃度計(jì)算中,采用式(1)的數(shù)據(jù)處理方法以消除NO2- -N的影響。
當(dāng)采用MPN-PCR結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算時(shí),按照MPN法的計(jì)數(shù)原則,計(jì)算樣品中的細(xì)菌數(shù)量:統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最后3個(gè)連續(xù)的稀釋度(10^x、10^x+1和10^x+2),根據(jù)這3個(gè)稀釋度平行樣中條帶的個(gè)數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)(abc ),從“每毫升稀釋液的細(xì)菌近似值”MPN表中查詢對(duì)應(yīng)的數(shù)值,采用式(2)的計(jì)算公式來(lái)計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。
每克菌塊中的細(xì)菌數(shù)量(個(gè)/ g)=(條帶數(shù)量指標(biāo)對(duì)應(yīng)的數(shù)值x最后3個(gè)稀釋度中第1個(gè)稀釋度的稀釋倍數(shù)x提取的DNA總量)/菌塊質(zhì)量(2)
2結(jié)果分析
2. 1馴化過(guò)程對(duì)脫氮過(guò)程的影響
厭氧氨氧化反應(yīng)可能是厭氧氨氧化細(xì)菌主要能量代謝途徑,所以反應(yīng)生化活性主要體現(xiàn)在NH4+-N去除濃度值的變化上。反硝化細(xì)菌在反硝化反應(yīng)中可以利用多種代謝途徑獲取能量,所以反應(yīng)生化活性主要體現(xiàn)在反硝化總脫氮量(NO2- -N和NO3- -N )上。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中建立的標(biāo)準(zhǔn),分析石油煉化廢水中COD和毒性物質(zhì)對(duì)于細(xì)菌混培物的影響。各階段的厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的生化活性見(jiàn)表3。
2.1.1第I一II階段
圖2所示為第I一II階段的脫氮影響。實(shí)驗(yàn)第I階段為細(xì)菌混培物的適應(yīng)期,所以采用與菌種原有環(huán)境相同(生物濾池運(yùn)行工況)以縮短適應(yīng)時(shí)間、保障處理效果。該階段實(shí)驗(yàn)原水中沒(méi)有添加石油煉化廢水,從NH4+-N與NO2- -N去除值可以看到厭氧氨氧化反應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定,此時(shí)的TN去除負(fù)荷為11. 978 kg·(m3·d),而反硝化細(xì)菌總脫氮量相對(duì)較小,所以該階段的細(xì)菌混培物中主要體現(xiàn)厭氧氨氧化細(xì)菌生化活性,而反硝化細(xì)菌生化活性存在但不明顯。
第II階段是馴化實(shí)驗(yàn)的初始階段,石油煉化廢水的添加比例較小,原水中COD和毒性物質(zhì)濃度均較低。從圖2中可以看到,該階段中NH4+-N與NO2- -N的平均去除值分別增加了1. 643和7. 052 mg / L,反硝化平均總脫氮量卻增加了3. 56倍,同時(shí)以吸附作用和反硝化反應(yīng)為主的去除方式可去除原水COD的61. 1%左右,其中反硝化反應(yīng)的去除比例占到45%左右。對(duì)于由厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌組成的協(xié)同脫氮系統(tǒng),添加的COD對(duì)反硝化反應(yīng)產(chǎn)生了明顯的促進(jìn)作用,而對(duì)于厭氧氨氧化反應(yīng)影響不大,說(shuō)明該脫氮系統(tǒng)增強(qiáng)了對(duì)COD的抗沖擊能力。
2. 1. 2第III一V階段
從圖3和4可以看出,第III一V階段中伴隨著石油煉化廢水添加比例的增大,原水中COD和毒性物質(zhì)濃度逐漸增加。進(jìn)行分析時(shí),以第I階段中NH4+-N除量作為NH4+-N理論去除值,以第II階段中反硝化總脫氮量作為反硝化理論總脫氮量,并以此分別作為衡量厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌活性指標(biāo)和變化標(biāo)準(zhǔn)。
對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌,NH4+-N去除平均值出現(xiàn)降低并且變化量逐漸增大,與NH4+-N理論去除值之間的差距依次增大,并且3個(gè)階段內(nèi)的NH4+-N去除值均出現(xiàn)了波動(dòng),但穩(wěn)定性卻越來(lái)越好。說(shuō)明該階段中厭氧氨氧化細(xì)菌生化活性已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的降低且降幅逐漸增大,也表現(xiàn)在整體TN去除負(fù)荷依次降低。由于實(shí)驗(yàn)出水中厭氧氨氧化反應(yīng)的底物NH4+-N和NO2- -N均有剩余,所以不斷添加的石油煉化廢水中COD和毒性物質(zhì)對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌產(chǎn)生了明顯的不利影響,但隨著馴化階段的進(jìn)行,細(xì)菌混培物對(duì)水質(zhì)產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性;對(duì)于反硝化細(xì)菌,利用原水中COD進(jìn)行反應(yīng)后,細(xì)菌生化活性出現(xiàn)了明顯增強(qiáng)且脫氮量逐漸增大,但相比反硝化理論總脫氮量的差距越來(lái)越大,第V階段的差量約是第III階段的2倍,推測(cè)由于石油煉化廢水添加比例的不斷增大,原水中的COD和毒性物質(zhì)濃度均增大,而進(jìn)水中可利用的NO2- -N和NO3- -N充足,所以COD濃度的增大一定程度上對(duì)于反硝化細(xì)菌產(chǎn)生了有利影響,但毒性物質(zhì)濃度的增加對(duì)反硝化細(xì)菌產(chǎn)生了明顯的負(fù)面作用。
另外,從表3中可以看出,第V階段細(xì)菌混培物中厭氧氨氧化細(xì)菌生化活性達(dá)到最低點(diǎn)而反硝化細(xì)菌生化活性達(dá)到最高點(diǎn),推測(cè)原因:一方面是該階段毒性物質(zhì)作用顯著,厭氧氨氧化細(xì)菌的世代時(shí)間較長(zhǎng)(約為11 d),使得死亡率大于生長(zhǎng)率,所以厭氧氨氧化活性出現(xiàn)了明顯下降,并且2種細(xì)菌之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)和相互影響;另一方面由于高濃度COD對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌產(chǎn)生了明顯沖擊作用,反硝化細(xì)菌卻可以利用部分COD保持正常的繁殖速率,使得生長(zhǎng)率大于毒性物質(zhì)造成的死亡率,所以反硝化細(xì)菌的數(shù)量增加對(duì)總體生化活性影響不明顯,并且此時(shí)的混培體系中反硝化細(xì)菌相對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌逐漸成為了優(yōu)勢(shì)菌種。
2. 1. 3第VI階段
第VI階段全部由石油煉化廢水組成,原水中高濃度的COD和毒性物質(zhì)均未經(jīng)過(guò)稀釋。從圖5和表3中看出NH4+-N平均去除值相比上一階段增加,階段內(nèi)NH4+-N去除值出現(xiàn)波動(dòng),并且與NH4+-N理論去除值之間的差距逐漸增大;反硝化平均總脫氮量相比上一階段減少,階段內(nèi)反硝化總脫氮量同樣波動(dòng)明顯。說(shuō)明該階段中高濃度COD和毒性物質(zhì)對(duì)于細(xì)菌混培物中的厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌均產(chǎn)生了明顯的不利影響,但由于長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)行可能出現(xiàn)了厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量的增加或細(xì)菌適應(yīng)性的加強(qiáng),所以反硝化細(xì)菌生化活性可以表現(xiàn)在反硝化平均脫氮量上,脫氮量減少了25.6%,而厭氧氨氧化細(xì)菌生化活性則可以表現(xiàn)在氨氮的平均去除值上,增加了2. 491 mg / L。
2. 2馴化過(guò)程對(duì)菌群的影響
采用分子生物學(xué)技術(shù)(MPN-PCR)對(duì)菌群在馴化階段前后的變化進(jìn)行分析,該方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)進(jìn)行PCR體外快速擴(kuò)增靶序列來(lái)取代細(xì)菌的分離培養(yǎng),不但極大地縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間,而且對(duì)樣品中不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類也可進(jìn)行計(jì)數(shù),從而使得結(jié)果更接近實(shí)際數(shù)量。
本實(shí)驗(yàn)首先在DNA提取方面嘗試了改進(jìn)的十六烷基三甲酸澳化錢( Hexadecyl trimethyl ammoniumBromide , CTAB ) /NaCI化學(xué)裂解法、改進(jìn)的傳統(tǒng)蛋白酶K一十二烷基磺酸鈉( Sodium dodecyl sulfate ,SDS)一氯仿異戊醇法(CPSCI法)和改進(jìn)的溶菌酶-SDS-蛋白酶K細(xì)胞裂解法3種提取方法,采用紫外分光光度法對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量測(cè)定,分別測(cè)定260 nm和280 nm的吸光度值,提取DNA的完整性需要通過(guò)瓊脂糖電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證,3種方法提取的DNA長(zhǎng)度均為23 kb左右,條帶輪廓清晰,亮度適宜,沒(méi)有明顯的彌散現(xiàn)象,表明提取的細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量較高,適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。吸光度值測(cè)量使用UV-2550紫外分光光度計(jì),測(cè)量結(jié)果如表4。由表4可以看出3種方法的A260/A280比值都大于1.8,蛋白質(zhì)去除效率和DNA提取質(zhì)量較高,3種方法均能夠很好的去除蛋白質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)。雖然存在一定程度的RNA干擾,但并不影響后續(xù)PCR的操作。所有3種方法都不需要進(jìn)行純化,可以直接得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,說(shuō)明這3種方法提取DNA是可行的。從提取的DNA濃度和純度兩方面,綜合考慮最終確定蛋白酶K-SDS法作為提取細(xì)菌混培物DNA的方法。
細(xì)菌混培物中的厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌擴(kuò)增所使用的引物見(jiàn)表5,PCR擴(kuò)增采用25 μL體系,各組分:PCR buffer 2. 5 μL, MgCl2 2 μL, dNTP 0. 5 μL,上下游引物各1 μL , Taq聚合酶0. 2 μL上海生工合成),模板1 μL,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。
PCR擴(kuò)增采用降落PCR ( Touchdown PCR, TD-PCR)技術(shù),采用的擴(kuò)增程序?yàn)?1)厭氧氨氧化細(xì)菌:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火40 s,72℃延伸40 s,每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0. 3℃,以上步驟循環(huán)25次;94 ℃變性30 s,55℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,以上步驟循環(huán)10次;72 ℃延伸10min ; 2)反硝化細(xì)菌:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1. 0 ℃,以上步驟循環(huán)10次;95 ℃變性30 s,50 ℃退火40 s , 72 ℃延伸1 min,以上步驟循環(huán)20次;72 ℃延伸10 min。
經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)方法和條件的嘗試、摸索和優(yōu)化,得到適用于該細(xì)菌混培物最適的DNA提取、PCR擴(kuò)增和MPN計(jì)數(shù)相結(jié)合體系。圖6所示是細(xì)菌混培物中厭氧氨氧化和反硝化細(xì)菌在馴化實(shí)驗(yàn)前后計(jì)數(shù)的電泳圖。
通過(guò)計(jì)算得到馴化前的厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量為7. 549 x 10^14和3. 523 x 10^6個(gè)/ g,馴化后的數(shù)量分別為8. 212 x 10^8和4. 693 x 10^16個(gè)/ g。對(duì)比2種細(xì)菌在馴化前后的數(shù)量,可以看出對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌來(lái)說(shuō),厭氧氨氧化反應(yīng)可能是厭氧氨氧化細(xì)菌主要能量代謝途徑,由于世代時(shí)間長(zhǎng)(約為11 d)、反硝化細(xì)菌數(shù)量的增加和毒性物質(zhì)作用的原因,造成厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量明顯減少和生化活性降低。而對(duì)于反硝化細(xì)菌來(lái)說(shuō),由于反應(yīng)可以利用多種代謝途徑獲取能量,所以基質(zhì)對(duì)細(xì)菌的影響相對(duì)較小,并且利用石油煉化廢水中的COD在細(xì)菌增殖上沒(méi)有受到影響而使數(shù)量增加,但毒性物質(zhì)對(duì)于反硝化細(xì)菌的生化活性產(chǎn)生了明顯的抑制。
3結(jié)論
1)厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的混培脫氮體系的脫氮生化活性并未與細(xì)菌數(shù)目的變化情況呈正相關(guān)性變化,說(shuō)明COD和毒性物質(zhì)產(chǎn)生了不同程度的影響。
2)厭氧氨氧化細(xì)菌比反硝化細(xì)菌對(duì)于石油煉化廢水毒性的作用更敏感。由于厭氧氨氧化細(xì)菌本身世代周期長(zhǎng),所以初期毒性負(fù)效應(yīng)作用較明顯,但經(jīng)馴化后厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)于高濃度COD和高毒性物質(zhì)具有一定的適應(yīng)性。在石油煉化廢水處理中,通過(guò)進(jìn)水負(fù)荷的控制,可以實(shí)現(xiàn)高于目前常用工藝技術(shù)的脫氮效率并實(shí)現(xiàn)節(jié)能。
3)混培脫氮體系在一定程度上可有效地抵抗石油煉化廢水高濃度COD、高毒性物質(zhì)對(duì)于厭氧氨氧化生理、生化脫氮過(guò)程的負(fù)面影響。反硝化細(xì)菌的存在對(duì)于厭氧氨氧化脫氮體系的穩(wěn)定和出水總氮指標(biāo)的降低,具有較好的促進(jìn)和保障作用。